酵母基因組DNA快速提取試劑盒 核酸提取
該試劑盒采用DNA吸附柱和du有的溶液系統(tǒng)，適合于從多種來源的酵母培養(yǎng)物中快速簡單地提取基因組DNA。約3ml處于指數(shù)生長期的酵母培養(yǎng)液一般一次抽提可純化出10-15μg的高質(zhì)量的基因組DNA。酵母基因組DNA快速提取試劑盒 核酸提取
酵母基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)
酵母基因組DNA快速提取試劑盒 核酸提取
目錄號：40210
目錄編號 | 包裝單位 |
40210-50 | 50次 |
40210-50-1 | 50次(帶蛋白酶K) |
40210-50-2 | 50次（帶Lyticase） |
40210-50-3 | 50次（帶蛋白酶K，帶Lyticase） |
v 適用范圍：
適用于快速提取各種酵母基因組DNA
v 試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性：
試劑盒組成 | 保存 | 50次 |
緩沖液YB | 室溫 | 20ml |
結(jié)合液CB | 室溫 | 11ml |
抑制物去除液IR | 室溫 | 25ml |
漂洗液WB | 室溫 | 15ml |
第一次使用前按說明加指ding量乙醇 | ||
洗脫緩沖液EB | 室溫 | 15ml |
Lyticase 10U/μl | 室溫 | 2500U |
蛋白酶K fen（可選）20mg/ml | 室溫 | 20mg |
吸附柱AC | 室溫 | 50個(gè) |
收集管（2ml） | 室溫 | 50個(gè) |
本試劑盒在室溫儲(chǔ)存12個(gè)月不影響使用效果。
儲(chǔ)存事項(xiàng):
1. 結(jié)合液CB或者抑制物去除液IR低溫時(shí)可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。
2. 為避免降低活性，方便運(yùn)輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀（20mg），收到后，可短暫離心后，加入1毫升滅菌水溶解配制成20mg/ml溶液，因?yàn)榉磸?fù)凍融可能會(huì)降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分裝凍存，－20℃保存。
3. 為避免降低活性，方便運(yùn)輸，提供Lyticase(2500U)為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，加入0.25毫升滅菌水溶解配制成10U/μl，因?yàn)榉磸?fù)凍融可能會(huì)降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分裝凍存，－20℃保存。
4. 避免試劑長時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。
v 產(chǎn)品介紹：
該試劑盒采用DNA吸附柱和du有的溶液系統(tǒng)，適合于從多種來源的酵母培養(yǎng)物中快速簡單地提取基因組DNA。約3ml處于指數(shù)生長期的酵母培養(yǎng)液一般一次抽提可純化出10-15μg的高質(zhì)量的基因組DNA。純化DNA產(chǎn)物可直接用于PCR、酶切和雜交等實(shí)驗(yàn)。酵母細(xì)胞經(jīng)lyticase處理去除細(xì)胞壁后，du特的結(jié)合液/蛋白酶K迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶，然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。
v 產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口世界有名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好。克服了國產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。
2. 不需要使用有毒的苯fen等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
3. 快速，簡捷，單個(gè)樣品裂解后操作一般可在30分鐘內(nèi)完成。
4. 多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達(dá)1.7～1.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應(yīng)。
v 注意事項(xiàng)：
1. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。
2. 需要自備乙醇、異丙醇、β-巰基乙chun。
3. 開始實(shí)驗(yàn)前將需要的水浴先預(yù)熱到37℃和70℃?zhèn)溆谩?/span>
4. 結(jié)合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
5. 用戶需要自備Sorbitol buffer( 1M 山梨chun，0.1M Na2EDTA，14 mMβ-巰基乙醇)。配制方法：在600 ml 去離子水里面溶解182.2克山梨chun，加入200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要調(diào)節(jié)PH值，定容到1L，4℃保存。臨用前加0.1%β-巰基乙醇(商品化的β-巰基乙醇摩爾濃度一般為14M)。
6. 菌體濃度檢測一般OD600值為1的時(shí)候,釀酒酵母細(xì)胞是1-2x107 cells/ml，由于菌種和分光度計(jì)不同即使同樣細(xì)胞數(shù)量OD值變化也很大，以上僅供參考。
7. 洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫，但應(yīng)該確保批pH大于7.5，pH過低影響洗脫效率。用水洗脫DNA應(yīng)該保存在－20℃。DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。
v 操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請先閱讀注意事項(xiàng)）
提示：
e 第一次使用前請先在15ml漂洗液WB中加入60ml無水乙醇，充分混勻，加入后請及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!
e 吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.1%β-巰基乙醇，回復(fù)到室溫備用。
1. 取1-3毫升酵母培養(yǎng)物(不超過3X107cells，最好是早對數(shù)生長期)，12,000rpm離心30秒，盡可能的吸棄上清，收集菌體。
收集超過1.5毫升菌液，可以離心棄上清后，在同一個(gè)1.5ml管內(nèi)加入更多的菌液，重復(fù)步驟1，直到收集到足夠的菌體。
2. 加入600μl Sorbitol buffer，輕柔吹打充分重懸細(xì)胞；可按照20-50U/1x107cells的比例加入Lyticase(一般3 ml培養(yǎng)物可能需要加到150U)，充分顛倒混勻，37℃溫育至少30分鐘消化細(xì)胞壁，中間可顛倒數(shù)次幫助消化。
如果破壁效果不好導(dǎo)致DNA產(chǎn)量低，可以加大lyicase用量來提高酶工作濃度，還可以延長消化時(shí)間來提高效果，不適合Lyticase消化的酵母可選用Zymolase或者其它方法如玻璃珠渦旋，煮沸，反復(fù)凍融等。
3. 13,000rpm離心1分鐘，盡可能吸棄上清，加180μl 緩沖液YB充分重懸細(xì)胞團(tuán)。
4. 加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。
5. 將混合物放置在55℃水浴消化直到消化wan全，期間輕柔的振蕩幾次幫助裂解。
所需消化時(shí)間和酵母數(shù)量、種類和生長狀態(tài)有關(guān)，一般15分鐘即可，但是如果方便的話消化過夜也無不良影響。
可選步驟，一般不需要: 如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可在完成操作步驟5后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。
6. 加入200μl結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，70℃放置10分鐘。
7. 冷卻后加入100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。
8. 將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。
9. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒，棄廢液。
10. 加入700μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。
11. 加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。
12. 將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
13. 取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中預(yù)熱效果更好），室溫放置3-5分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。
洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積，但是最小體積不應(yīng)少于50μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。
14. DNA可以存放在2-8℃，如果要長時(shí)間存放，可以放置在－20℃。
v 問題與解決方法
問題 | 評論與建議 |
DNA產(chǎn)量低 | *某些種類酵母裂解困難-建議：仔細(xì)閱讀步驟2，確認(rèn)處理的酵母種類可以用lyticase裂解，還可以考慮選用其它裂解方法如Zymolase、玻璃珠渦旋、煮沸、反復(fù)凍融等，lyticase最好按照使用量分裝凍存，保證有效性，使用早對數(shù)生長期酵母。 *蛋白酶K失效了-建議：按照每次使用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融，延長處理時(shí)間。 *裂解不wan全或者和異丙醇沒有充分混勻-建議：加入結(jié)合液后，和加入蛋白酶K后立即吹打或者渦旋混勻；加入異丙醇后立即吹打或者渦旋混勻才加入吸附柱，如果太粘稠必須渦旋振蕩15秒充分混勻。 |
DNA降解了 | *組織中核酸酶活性導(dǎo)致降解-建議：樣品處理前妥善保存在－20℃，處理量不要過量。 |
未提取到DNA | *漂洗液WB中忘記加無水乙醇-建議：第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，在漂洗液WB中加入指ding量無水乙醇。 |
洗脫下來的 | *離心柱殘留有較多乙醇或者底部不慎沾有乙醇-建議：確保做了步驟12，否則殘留乙醇會(huì)影響洗脫效率。 *使用了水或者其它非優(yōu)良液體代替洗脫緩沖液-建議：仔細(xì)閱讀注意事項(xiàng)7和步驟13和只使用洗脫緩沖液EB洗脫。 |
A260吸光值 | *一些硅基質(zhì)膜成分一起洗脫下來，干擾了吸光值-建議：將洗脫的基因組DNA溶液13,000rpm再離心一分鐘，小心取上清使用。 |
DNA下游酶切 | *一些硅基質(zhì)膜成分一起洗脫下來，抑制了酶切反應(yīng)-建議：將洗脫的基因組DNA溶液13,000rpm再離心一分鐘，小心取上清使用。 *離心柱殘留有較多乙醇或者底部不慎沾有乙醇抑制了酶切反應(yīng)-建議：確保做了步驟12，然后空氣中晾幾分鐘，讓殘留乙醇揮發(fā)。 |
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